AEG Arctis 1310 i Manual do Utilizador

Untersuchung zur Speicherung und Funktion von Sulfatid in Neuronen anhand von transgenen Mäusen I n a u g u r a l - D i s s e r t a t i o n

1 Einleitung 41.2 Lipide: Struktur und Funktion der Sphingolipide Lipide stellen eine Klasse von Molekülen dar, deren strukturelle und biologisc

3 Ergebnisse 94 Abb. 3.14: Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeschnitten der Medulla oblangata mit dem neuronalen Marker ß-III-Tubulin. Co-Färbung

3 Ergebnisse 95 Abb. 3.15: Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeschnitten der Mendulla oblangata mit dem neuronalen Marker NSE. Co-Färbung von 12-14

3 Ergebnisse 963.2.4 Lipidanalyse und Vergleich der beiden ASA-Knockout-Stämme C57BL/6 und 129/Ola Zur Untersuchung der MLD wurde ein Mausmodell

3 Ergebnisse 97 Abb. 3.16: Analyse und Quantifizierung der Lipide des Gehirns von 12 und 20 Monate alten C57BL/6 und 129/Ola Mäusen. Die Lipide wu

3 Ergebnisse 98 Abb. 3.17: Analyse und Quantifizierung der Lipide der Niere von 12 und 20 Monate alten C57BL/6 und 129/Ola. Die Lipide wurden auf

3 Ergebnisse 993.1.5 Zusammenfassung der Daten zu den biochemischen und immunhistochemischen Untersuchungen an MLD-Mausmodellen Anhand der Unters

3 Ergebnisse 1003.2 Transgene Thy-1-CGT-Mäuse: Analyse der letalen audiogenen Anfälle bei transgenen Mäusen, die einen erhöhten Sulfatid-Gehalt in

3 Ergebnisse 101 Abb. 3.18: In situ-Hybridisierung von Thy-1-CGT-Mäusen. In A ist die Struktur des CGT-Transgen- Konstrukt dargestellt, das zur Ge

3 Ergebnisse 1023.2.2 Analyse der Überlebensdauer und der audiogenen Anfälle der Thy-1-CGT-Mäuse Bei den transgenen Mäusen war unabhängig vom gen

3 Ergebnisse 103 Abb. 3.19: Überlebenskurve und letale audiogene Anfälle von transgenen Thy-1-CGT-Mäusen. In A ist die Kaplan-Meier-Überlebenskurv

1 Einleitung 5Die Ausgangssubstanz von Sphingomyelinen (Phosphosphingolipide) und Glykosphingolipiden ist Ceramid. Ceramid besteht aus einer Fettsä

3 Ergebnisse 104starben zwischen 35 % (tg 4743) und 75 % (tg 4747) der transgenen Mäuse innerhalb von 20 Sekunden an Atemstillstand (Abb. 3.17 B).

3 Ergebnisse 105 Abb. 3.20: Ergebnisse des „Open-field“-Verhaltenstests mit sechs bzw. 17 Monate alten Thy-1 CGT Mäusen. Darstellung von Teilergeb

3 Ergebnisse 1063.2.3 Induktion und Bestimmung der c-Fos-Expression im Colliculus inferior bei Thy-1-CGT-Mäusen Ein spezieller Bereich im Gehirn

3 Ergebnisse 107 Abb. 3.21: c-Fos-Immunhistochemie des Colliculus inferior. In A ist die c-Fos Expression (schwarze Punkte) in den transgenen Mäus

3 Ergebnisse 108 Abb. 3.22: In situ-Hybridisierung mit c-Fos-Immunhistochemie im Colliculus inferior. In A sind die Färbungen mit der CGT-RNA-Sond

3 Ergebnisse 109 Abb. 3.23: Western-Blot und Lipid-Analyse des Gehirns von Thy-1-CGT-transgenen Mäusen. A: 50 µg Protein aus dem Homogenat (H) und

3 Ergebnisse 110 Abb. 3.24: Quantitative Bestimmung der Sulfatid-Spezies in der Plasmamembran von Thy-1-CGT- Mäusen. A: Repräsentative ESI-Spektr

3 Ergebnisse 1113.2.5 Analyse der Ganglioside von transgenen Thy-1-CGT-Mäusen In der Literatur wird beschrieben, dass letale audiogene Anfälle mi

3 Ergebnisse 112 Abb. 3.25: Analyse der Ganglioside von transgenen Thy-1-CGT-Mäusen. Ganglioside aus den Gehirn-Bereichen des Colliculus inferior,

3 Ergebnisse 113GalCer (Eckhardt et al., 2007). Die ESI-MS Untersuchung der kortikalen Lipide zeigte einen erhöhten C18:0-Sulfatid-Peak (Massen-Pea

1 Einleitung 6 Abb. 1.3: Sphingomyelin. Das Grundgerüst bildet das Sphingosin. An die C2-Aminogruppe ist eine Fettsäure über eine Amidbindung verk

3 Ergebnisse 114Diese Ergebnisse zeigen, dass der Anstieg an C18:0-GalCer und C18:0-Sulfatid der einzige signifikante Unterschied in der Lipidzusam

3 Ergebnisse 115Aufgrund dieser Ergebnisse, wurde eine Analyse der Plasmamembran von diesen transgenen Mäusen durchgeführt. Zunächst erfolgte eine

3 Ergebnisse 116 Abb. 3.27: Aufreinigung und Lipid-Analyse der Plasmamembran von transgenen Mäusen mit dem gemischten Hintergrund C57BL/6 x 129 Ol

3 Ergebnisse 1173.2.7 Zusammenfassung der Ergebnisse der biochemischen und ESI-MS Untersuchungen an den transgenen Thy-1-CGT-Mäusen Die biochemis

3 Ergebnisse 1183.3 In vitro Zellkulturversuche an der Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) Die Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) ist ein Typ II-Tra

3 Ergebnisse 119 Abb. 3.28: Schematische Darstellung der CST-Konstrukte. Die Aminosäure-Position des jeweiligen Anfangs der CST-Konstrukte nach de

3 Ergebnisse 120 Abb. 3.29: Expression der CST-Konstrukte und deren Aktivitäts-Nachweis. CHO-K1-Zellen, die mit den fünf CST-Konstrukten transfizi

3 Ergebnisse 121keine wesentliche Verschiebung des Proteins in den Kulturüberstand stattgefunden und der Großteil der Proteine verblieb weiterhin i

3 Ergebnisse 122des MAL-HA-Proteins mit der CST gezeigt. Zuerst ist die Co-Färbung von MAL-HA in der stabilen CST-Zelllinie gezeigt (D) und dann fo

3 Ergebnisse 123 Abb. 3.31: Co-Färbung der CST mit MAL-HA in CHO-K1- und 39CST-CHO-Zellen. A zeigt die mit der 39CST stabil transfizierten Zellen

1 Einleitung 7 Abb. 1.4: CST katalysiert die Synthese von Sulfatid und SLacCer. (modifiziert nach Eckhardt et al., 2007). CGT = Cerebrosid-Galakto

3 Ergebnisse 124 Abb. 3.32: Co-Färbung der CST mit PLP-HA in CHO-K1- und 39CST-CHO-Zellen. A zeigt die mit der 39CST stabil transfizierten Zellen

3 Ergebnisse 125das ca. 34 kDa groß ist. Die Western-Blot-Membran wurde mit beiden Antikörpern zusammen inkubiert. Allerdings konnte MAL nicht dete

3 Ergebnisse 126 Abb. 3.34: Expressions-Nachweis der DPPIV(TM)-39CST-HA in CHO-K1 Zellen. 48 h nach der Transfektion wurden die transfizierten Zel

3 Ergebnisse 127

3 Ergebnisse 128Abbildung 3.35 I zeigt eine deutliche Co-Lokalisation von DPPIV(TM)-39CST-HAund dem ER Protein Calnexin in transient transfizierten

3 Ergebnisse 1293.3.4 Subzelluläre Lokalisation der humanen Gal3-Sulfotransferase 1, 2 und 4 Aufgrund der Tatsache, dass die CST in der Zelle ve

3 Ergebnisse 130Bestimmung der Lokalisation wurden Co-Färbungen mit Calnexin, das im ER lokalisiert ist, und mit dem Konstrukt CST1-36-GFP, das als

3 Ergebnisse 131 Abb. 3.37: Co-Färbung der humanen Sulfotransferasen Gal3ST1, Gal3ST2 und Gal3St4 mit ER- und Golgi-Proteinen. A: Golgi-Lokalisati

3 Ergebnisse 1323.3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse zur subzellulären Lokalisation der CST Die biochemischen Untersuchungen sowie die Immunfluor

4 Diskussion 133 4. Diskussion "Lysosomale Speicherkrankheiten" sind zurückzuführen auf Defekte von lysosomalen und nicht-lysosomalen

1 Einleitung 81.4 Synthese und Abbau von Sulfatid Sulfatid (3-O-Sulfogalaktosylceramid) ist zusammen mit Sphingomyelin eines der ersten Sphingoli

4 Diskussion 1344.1 Sulfatid-Akkumulation in Neuronen von ASA- und ASA/ApoE-defizienten Mäusen Zurzeit ist noch wenig bekannt, welchen Effekt ei

4 Diskussion 135Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Sulfatid-Akkumulation in den Neuronen von ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen. Dabei sollte ge

4 Diskussion 136desselben Moleküls variieren können (Isaac et al., 2006). Das Sulfatid der Myelinscheiden hat beispielsweise mehrheitlich langketti

4 Diskussion 137Die Resultate deuten darauf hin, dass ApoE keine wesentliche Rolle bei dem Transport von Sulfatid zu den Neuronen zukommt. Die In

4 Diskussion 138Vergleicht man die Resultate der histologischen Untersuchung mit denen der Lipidanalyse, läßt sich zusammenfassend sagen, dass ApoE

4 Diskussion 139durch ein Abbau-Defizit von Myelin-Komponenten wie Sulfatid bewahren. Auf diese Weise wäre es möglich, dass Oligodendrozyten der AS

4 Diskussion 1404.2 Analyse der Thy-1 CGT-Mäuse: C18-langkettiges Sulfatid löst letale audiogene Anfälle in transgenen Thy-1 CGT-Mäusen aus Sofe

4 Diskussion 141Bildung von Galaktosyl-Cerebrosid, das durch das Enzym Cerebrosid-Sulfotransferase (CST) zu Sulfatid umgewandelt wird. Es konnte fe

4 Diskussion 142durchgeführt. Eine erhöhte c-Fos-Expression im Bereich des CI ist von besonderem Interesse, denn der Colliculus inferior zählt zu d

4 Diskussion 143intensiven akustischen Reiz ausgelöst werden (Faingold et al., 1991a, b und 2000; Li et al., 1999; Zhang & Kelly, 2001). Wie ko

1 Einleitung 9aus der Membran herauslöst und somit der ASA zugänglich macht (Kolter & Sandhoff, 2005; Eckhardt, 2008). GalCer wird mit Hilfe de

4 Diskussion 144Meynell et al., 1998). Durch die Bindung von ATP an den KATP-Kanal-Komplex erfolgt eine Schließung des Kanals, was zur Anreicherung

4 Diskussion 145jedoch wurde bei den transgenen CGT/CST-Mäusen in der neuronalen Plasmamembran ein wesentlich höherer Anstieg an C18:0-kettigem Sul

4 Diskussion 146der Ganglioside von transgenen CGT-Mäusen ergab jedoch keinen signifikanten Anstieg an GM3 oder anderen Gangliosiden. Ferner wurde

4 Diskussion 1474.3 Subzelluläre Lokalisations-Analyse der Cerebrosid-Sulfotransferase (CST): Retention der CST im Endoplasmatischen Retikulum In

4 Diskussion 1481996). Dies verdeutlicht, dass die Inhibition der CGT sowie der CST eine mögliche Option ist, die Sulfatidakkumulation bei der MLD

4 Diskussion 149Es wird vermutet, dass die ER-Retention der CST durch ihre luminale katalytische Domäne vermittelt wird. Gestützt wird diese Theori

4 Diskussion 150N-Acetyl-Glucoaminyltransferase I (NAGT I) und Mannosidase II (Mann II) zeigen zum Beispiel, dass NAGT I und Mann II spezifisch übe

4 Diskussion 151Fehlfaltung durchmacht oder nicht, und ob die Aggregate permanent oder nur transient sind, hängt von verschiedenen Faktoren ab. Die

4 Diskussion 1524.4 Ausblick Das Modell des Sulfatid-Transports von Oligodendrozyten zu Neuronen mit Hilfe von Apolipoprotein-E, das aus Astrozyt

4 Diskussion 153Eine immunhistochemische-Analyse von GABA oder Glutamat sowie ein Aktivitäts-Nachweis der beiden Neurotransmitter würde dazu beitra

1 Einleitung 10Möglichkeit ist, dass Sulfatid mit Hilfe von Rezeptor-vermittelter Endozytose in Neurone transportiert wird (Han, 2007). ApoE enthal

5 Zusammenfassung 154 5 Zusammenfassung Metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine genetisch bedingte Defizienz des lysosomalen Enzyms Aryl

5 Zusammenfassung 155Hintergrund eine signifikant reduzierte Lebensspanne auf. Zusätzlich wurde bei den transgenen CGT-Mäusen eine erhöhte Empfindl

6 Abstract 156 6 Abstract An inherited deficiency for lysosomal enzyme Arysulfatase A (ASA) leads to 3-O-sulfo-galactosylceramide (sulfatide) ac

6 Abstract 157neurons. Depending on the genetic background, these transgenic mice have a significantly reduced life span; e.g. mice on a C57Bl/6 ba

7 Literatur 158 7 Literatur • Arvanitis D., Dumas M., Szuchet S. (1992). Myelin palingenesis. 2. Immunocytochemical localization of myelin/olig

7 Literatur 159• Berntson Z., Hansson E., Rönnbäck L., Fredman P. (1998). Intracellular sulfatide expression in a subpopulation of astrocytes in p

7 Literatur 160channel activity and Ca(2+)-dependent exocytosis in rat pancreatic beta-cells. Diabetes 51:2514-2521. • Buschard K., Blomqvist M.,

7 Literatur 161• D’Hooge R., Hartmann D., Manil J., Colin F., Gieselmann V., De Deyn P.P. (1999b). Neuromotor alterations and cerebellar deficits

7 Literatur 162• Eto Y., Shen J.S., Meng X.L., Ohashi T. (2004). Treatment of lysosomal storage disorders: cell therapy and gene therapy. J Inheri

7 Literatur 163• Fredman P., Mattsson L., Andersson K., Davidsson P., Ishizuka I., Jeansson S., Månsson J.E., Svennerholm L. (1988). Characterizat

1 Einleitung 11Interessanterweise zeigten Myelin- und Lymphozyten Protein (MAL)-defiziente-Mäuse ähnliche Veränderungen der Nerven (Schaeren-Wiemer

7 Literatur 164• Hammond C. & Helenius A. (1995). Quality control in the secretory pathway. Curr Opin Cell Biol 7:523–529. • Han X, M Holtzma

7 Literatur 165• Horak M. & Wenthold R. J. (2009). Different roles of C-terminal cassettes in the trafficking of full-length NR1 subunits to t

7 Literatur 166• Karlsson K.A. (1981). Animal Glycosphingolipids as membrane attachment sites for bacteria. Annu Rev Biochem 58:309-350. • Kawai

7 Literatur 167• Kwon J. & Pierson M. (1997). Fos-immunoreactive responses in inferior colliculi of rats with experimental audiogenic seizure

7 Literatur 168(ASA) and of double-knockout mice deficient for ASA and galactosylceramide synthase. Histochem Cell Biol 116:161-169. • Maceyka M.

7 Literatur 169• Molander-Melin M., Pernber Z., Franken S., Gieselmann V., Månsson J.E., Fredman P. (2004). Accumulation of sulfatide in neuronal

7 Literatur 170Hirahara Y., Tadano-Aritomi K., Ishizuka I., Tedder T.F., Makino H. (2004). Cerebroside sulfotransferase deficiency ameliorates L-se

7 Literatur 171• Pohlentz G., Klein D., Schwarzmann G., Schmitz D., Sandhoff K. (1988). Both GA2, GM2, and GD2 synthases and GM1b, GD1a, and GT1b

7 Literatur 172• Reddy A., Caler E.V., Andrews N.W. (2001). Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes. Cell 106

7 Literatur 173• Schaeren-Wiemers N., Bonnet A., Erb M., Erne B., Bartsch U., Kern F., Mantei N., Sherman D., Suter U. (2004). The raft-associated

1 Einleitung 12Tabelle 1. Verschiedene Glykosphingolipid-Speicherkrankheiten. Dargestellt sind die jeweilige Speicherkrankheit mit dem entsprechend

7 Literatur 174• Seko A., Hara-Kuge S., Yamashita K. (2001). Molecular cloning and characterization of a novel human galactose 3-O-sulfotransferas

7 Literatur 175• Storrie B., White J., Röttger S., Stelzer E.H.K., Suganuma T., Nilsson T. (1998). Recycling of Golgi-resident glycosyltransferase

7 Literatur 176• van der Bijl P., Lopes-Cardozo M., van Meer G. (1996). Sorting of newly synthesized galactosphingolipids to the two surface domai

7 Literatur 177• Yaghootfam A., Gieselmann V., Eckhardt M. (2005). Delay of myelin formation in arylsulphatase A-deficient mice. Eur J Neurosci 21

8 Abbildungsverzeichnis 178 8 Abbildungsverzeichnis 1.1: Schematische Darstellung eines Neurons ………………………………… 3 1.2: Ceramidsynthese ………………

8 Abbildungsverzeichnis 1793.6: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker HRP-3 im Cortex ………………………………………………..………... 84 3.7:

8 Abbildungsverzeichnis 1803.23: Western-Blot und Lipid-Analyse des Gehirns von Thy-1-CGT-transgenen Mäusen …………………………………………... 109 3.24: Quan

10 Plasmidkarten 18110 Plasmidkarten

10 Plasmidkarten 182

10 Plasmidkarten 183

1 Einleitung 13Nach der Zuckerabspaltung entsteht Ceramid, welches zu Sphingosin und einer langkettigen Fettsäure abgebaut wird. Die so entstandene

10 Plasmidkarten 184

11 Abkürzungsverzeichnis 185 11 Abkürzungsverzeichnis Anm Absorption bei einer Wellenlänge Abb. Abbildung AK Antikörper Amp

11 Abkürzungsverzeichnis 186mA Milli-Ampère MAG (S/L) Myelin assoziiertes Glykoprotein (kurz/lang) MALDI Matrixassoziierte Laser Desorpti

i Danksagung Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Biochemie und Molekularbiologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn ang

ii Eidesstattliche Erklärung Ich versichere, dass ich die von mir vorgelegte Dissertation selbständig angefertigt, die benutzten Quellen und Hilfsm

iii Lebenslauf Curriculum Vitae Dipl. Biolog. Rebekka Maria van Zyl PERSÖNLICHE DATEN Name: Rebekka Maria van Zyl (geb. B

Berichterstatter: Prof. Dr. G. Schwarz Prof. Dr. V. Gieselmann Tag der mündlichen Prüfung: 26.10.20

1 Einleitung 141.6 Metachromatische Leukodystrophie (MLD) Die Leukodystrophien sind genetisch bedingte progressive Krankheiten, die das Gehirn,

1 Einleitung 15Die drei Formen sind die spät infantile, die juvenile und die adulte Form. Die spät-infantile Form tritt im Alter zwischen 6 Monaten

1 Einleitung 16auch im Myelin zu finden (Saravanan et al., 2004). Inwiefern sich nun diese intrazelluläre Speicherung und/oder die erhöhte Menge an

1 Einleitung 171.7 Mausmodelle der metachromatischen Leukodystrophie Metachromatische Leukodystrophie ist eine genetische Erkrankung und wurde n

1 Einleitung 18Erste Hinweise bezüglich der Überregbarkeit von Neuronen, wurden bei den ASA-defizienten-transgenen CGT-Mäusen beobachtet. Diese Mäu

1 Einleitung 19Ein zusätzliches Projekt dieser Arbeit ist die Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehung der Cerebrosid-Sulfotransferase (CST). Di

2 Material und Methoden 20 2 Material und Methoden 2.1 Materialien und Chemikalien Alle verwendeten Chemikalien, Enzyme und Kulturmedien wu

2 Material und Methoden 212.1.1 Geräte und Verbrauchsmaterial 2.1.1.1 Geräte Gerät Firma Agarosegelkammern mit Zubehör Eigenb

2 Material und Methoden 22Schüttelinkubator New Brunswick Scientific, Edison/New Jersey, USA Spectrophotometer DU 640 Beckmann, München Sterilban

2 Material und Methoden 232.1.1.2 Verbrauchsmaterialien Material Firma DC-Aluminiumfolien 20x20cm Kieselgel Merck, Darmstadt 60 F25

Inhaltsverzeichnis I1 Einleitung...

2 Material und Methoden 24Glukose Sigma-Aldrich, Steinheim Glycerin Merck, Darmstadt Histo Green Linaris, Wertheim - Bettingen n-Hex

2 Material und Methoden 252.1.3 Kits Kit Firma QIAprep DNA Mini Kit Qiagen, Hilden QIAprep Spin Mini Preparation Kit Qia

2 Material und Methoden 26 Poly-L-Lysin Sigma-Aldrich, Steinheim Trypsin (Trypsin/EDTA Lösung 1x) Gibco / Invitrogen, Karlsruhe Trypan

2 Material und Methoden 272.1.7 Lösungen 2.1.7.1 Nährmedien für Bakterienkulturen Name Zusammensetzung LB (Luria Bertani)- Medi

2 Material und Methoden 28 Kanamycin: Stammlösung: 10 mg/ml in H2O Arbeitskonzentration: 20 µg/ml Lysostaphin Stammlösung: 2,5 mg/m

2 Material und Methoden 29 Permeabilisierungs-/Blockingpuffer 0,05% Tween 20, (für den Nachweis von Sulfatid in Gewebe) 1% BSA / PBS 2.1.7.4

2 Material und Methoden 30 10 x Laufpuffer 250 mM Tris-Base 1,9 M Glycin 1% SDS; pH auf 8,6 einstellen 4 x Probenpuffer 8% SDS 40% G

2 Material und Methoden 31Ponceau-Lösung 0,2% Ponceau S 3% Trichloressigsäure TBS/T 1 x TBS 0,5% Tween 20 10 x PBS 100 mM Na2HPO4

2 Material und Methoden 32AP-Puffer 100 mM Tris-HCl pH 9,5 frisch ansetzen 100 mM NaCl 50 mM MgCl2 DC-Färbelösung 625 mM Kupfersulf

2 Material und Methoden 332.1.8 Bakterienstämme Bezeichnung Herkunft E.coli XL1-blue Bullock et al., 1987 supE44, hsdR17, recA1,

Inhaltsverzeichnis II2.4.2 Immunfluoreszenz-Färbung ... 44 2.4.2.1 Immunf

2 Material und Methoden 34psB4.7-39CST* enthält die Cerebrosid-Sulfotransferase ohne Transmembran-Domäne und um 6 Basenpaare verkürzt (für stabile

2 Material und Methoden 35Tabelle 2.1 : Verzeichnis der genutzten Primer lfd. Nr. Bezeichnung Sequenz Länge eingesetzt für 1734 39 CST

2 Material und Methoden 362545 T7an_cFosse CGCATGATGTTCTCGGGTTTCAACG 25 RNA-Sonden 2546 T7an_cFosan GTAATACGACTCACTATAGGGTCACAGGGCCAGCAGCGTGG

2 Material und Methoden 372.1.12 Verzeichnis der Antikörper Zur Detektion von Proteinen im Western-Blot und in der Immunohistochemie wurden fol

2 Material und Methoden 382.2 Versuchstiere 2.2.1 Wildtyp-Kontrolltiere Als Kontrollen wurden Tiere der Stämme C57BL/6, 129Ola und C57BL

2 Material und Methoden 392.3 Anfertigung von Gewebeschnitten Um verschiedene Untersuchungen wie Anfärbungen von Proteinen und histologische Un

2 Material und Methoden 402.4 Mikrobiologische und Molekularbiologische Methoden 2.4.1 In vitro Transfektion von Zellen 2.4.1.1 Kultivierung v

2 Material und Methoden 41und 1 ml der Zellsuspension wurde in 6 ml DMEM in einer 25 cm2 Zellkulturflasche kultiviert. 2.4.1.3 Zellzahl- und Vit

2 Material und Methoden 42 Abb. 2.1: Der Polyethylenimin-DNA-Komplex wird über Endozytose in die Zelle aufgenommen (modifiziert nach Fermentas).

2 Material und Methoden 43Transfektion: Von den vorbereiteten Zellen wurde das Medium abgenommen und je 300 µl serumfreies Medium zu den Zellen ge

Inhaltsverzeichnis III3. Ergebnisse ...

2 Material und Methoden 44Herstellung des DNA- Liposomen-Komplexes: Zur Herstellung des DNA-Liposomen-Komplexes wurde folgender Ansatz pipettiert:

2 Material und Methoden 45die von den Antikörpern erkannt werden, zu erhalten, müssen die ausgewählten Bereiche vorsichtig fixiert werden. Die Sich

2 Material und Methoden 46gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Nach dem Waschen wurde der Sekundärantikörper ebenfalls für 60 Minuten

2 Material und Methoden 472.5.2 Lagerung von Bakterien Für die längere Aufbewahrung von Bakterienstämmen bei –80°C wurden 7 % DMSO-Stocks angeleg

2 Material und Methoden 48bei hohen Salzkonzentrationen Plasmid-DNA zu binden. Die gebundene Plasmid-DNA kann dadurch sehr einfach gewaschen und an

2 Material und Methoden 49Um zu kontrollieren, ob das gewünschte Plasmid isoliert wurde, erfolgte ein Restriktionsverdau mit der eluierten DNA eine

2 Material und Methoden 50260 nm. Ein Absorptionsmaximum von 280 nm haben die Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin. Für doppelsträngige DNA entspri

2 Material und Methoden 51 Der Reaktionsansatz wurde für 5 Minuten bei 70°C und dann für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde eine Inku

2 Material und Methoden 52Die Temperatur für die Primer-Anlagerung hängt von deren Schmelztemperatur und damit von der Länge und Basenzusammensetzu

2 Material und Methoden 53präzipitiert (vgl. folgender Abschnitt) und je nach Bedarf weiter verarbeitet oder gelagert (bei -20°C). 2.5.3.11 Saure

Inhaltsverzeichnis IV7 Literatur...

2 Material und Methoden 542.5.3.13 Ligation Die Einbringung eines DNA-Fragmentes (Insert) in einen linearisierten Vektor, ebenso wie die Verknüpfu

2 Material und Methoden 552.5.3.14 Herstellung von Adaptern Für die Erstellung von sehr kleinen DNA-Fragmenten, die mittels PCR-Amplifikation n

2 Material und Methoden 56inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Entfernung der DNA durch Zugabe von 2 μl RNase-freier DNase I (10 U/μl) bei 37°C für

2 Material und Methoden 57anschließend für 8 Minuten in 0,2 M HCl und danach für 10 Minuten in 0,1 M TEA-Lösung inkubiert. In der Zwischenzeit wur

2 Material und Methoden 58Minuten bei 4°C zur Abtrennung der Zelltrümmer. Die löslichen Proteine befanden sich im Überstand und wurden zur weiteren

2 Material und Methoden 59Konzentration des Trenngels wurde je nach Größe des zu untersuchenden Proteins angeglichen. Die Konzentration verringert

2 Material und Methoden 60Maxi-Gel: 25 mA je Gel mit einer Spannungsbegrenzung auf 500 V Nachdem die Lauffront den unteren Rand des Gels erreicht h

2 Material und Methoden 61Blocklösung verdünnt und für 1.5h bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Membran 3 x für je 10 Minuten in TBS/Tw

2 Material und Methoden 622.6.3.2 Immunhistochemischer Nachweis von Sulfatid in Gewebe Mit Hilfe des SulphI Antikörpers (Fredmann et al., 1988)

2 Material und Methoden 632.6.3.4 Immunhistochemie mittels ABC-Methode Parafinschnitte wurden verwendet, wenn diese vorher durch eine Xylolrei

1 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Das Nervensystem der Vertebrata Das Nervensystem von Vertebraten ist ein Netzwerk von spezialisierten Zellen.

2 Material und Methoden 64ABC-Komplexes an den biotinylierten Sekundärantikörper war somit das Antigen mit einem großen Komplex „markiert“, was zu

2 Material und Methoden 65Das Pellet wurde in 9 ml 30% Saccharose aufgenommen, in Ultrazentrifugenröhrchen überführt, vorsichtig mit 2-3 ml 10,5% S

2 Material und Methoden 662.6.5 Cerebrosid-Sulfotransferase-Assay Die transfizierten Zellen wurden in 20 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl (pH 7,0) mit

2 Material und Methoden 67Die Suspensionen wurde in einem 10fachen Überschuss an Chloroform / Methanol (2:1) aufgenommen und in ein Pyrex-Röhrchen

2 Material und Methoden 68Glasfläschchen mit Teflondeckel überführt. Die Lipide wurden bis zur Analyse bei –20°C gelagert. 2.6.6.3 Lipidextraktion

2 Material und Methoden 69Für Ganglioside wurden das Laufmittel Chloroform / Methanol / 0.22% CaCl2 (60:35:8) und für die Cerebroside Chloroform /

2 Material und Methoden 702.6.7 ESI-MS (Elektrospray Ionisation-Massen Spektrometrie) von Lipiden Elektorspray-Ionisation-Massen-Spektrometrie

2 Material und Methoden 712.7.2 Genotypisierung der Mäuse Die Genotypisierung diente zur Überprüfung der Maus-Genotypen und wurde standardmäßig

2 Material und Methoden 72Maus eine Lichtschranke passierte, wurde es mit Hilfe der Activity Software Version 4.36 (Med. Associates Inc., St. Alban

3 Ergebnisse 73 3. Ergebnisse Die metachromatische Leukodystrophie (MLD) ist eine lysosomale Speicherkrankheit die auf einen Gendefekt des Enzy

1 Einleitung 2Astrozyten bilden die Mehrheit der Gliazellen im ZNS. Sie kommen sowohl in der weißen Substanz als fibrillenreiche Faserglia vor, als

3 Ergebnisse 743.1 MLD-Mausmodell: ASA- und ASA/ApoE–Knockout Mäuse ASA-defiziente Mäuse, die als Mausmodell der MLD erzeugt worden sind (Hess et

3 Ergebnisse 75 Abb. 3.1: Überlebenskurve der ASA/ApoE-Knockout-, ASA-Knockout- und Wildtyp-Mäuse (wt). Die ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Tiere wiesen

3 Ergebnisse 76 Abb. 3.2: Analyse und Quantifizierung der Lipide des Cortex und des Gesamtgehirns von 12 und 18-24 Monate alten Mäusen. Analysier

3 Ergebnisse 77Die Analyse der Lipide mittels Dünnschichtchromatographie ließ Unterschiede im GalCer- und im Sulfatid-Gehalt zwischen Wildtyp und d

3 Ergebnisse 78von Wildtyp-, ApoE-Knockout-, ASA-Knockout- und ASA/ApoE-Knockout-Mäusen zu charakterisieren. Repräsentative Massenspektren von den

3 Ergebnisse 79 Abb. 3.3: Massenspektren und quantitative Auswertung der aus dem Cortex isolierten Lipide. Gesamtlipide, die aus dem Cortex 12 und

3 Ergebnisse 80 Abb. 3.4: Massenspektren und quantitative Auswertung der aus dem Gesamtgehirn isolierten Lipide. Lipide, die aus dem Gehirn ohne Co

3 Ergebnisse 813.1.3 Histochemische und Immunfluoreszenz-Analysen der ASA- und ASA/ApoE-Knockout-Mäuse: Bei den biochemischen Untersuchungen de

3 Ergebnisse 82Stammhirn gezeigt. Das HRP-3- bzw. NeuN-Signal ist braun gefärbt, die Sulfatid-Speicherung blau. Schon im Alter von einem Jahr war

3 Ergebnisse 83 Abb. 3.5: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker HRP-3 im Kleinhirn. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnsc

1 Einleitung 3 Abb. 1.1: Schematische Darstellung eines Neurons. Oligodendrozyten bilden eine isolierende Myelinschicht um die Axone der Neuronen.

3 Ergebnisse 84 Abb. 3.6: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker HRP-3 im Cortex. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnschni

3 Ergebnisse 85 Abb. 3.7: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker HRP-3 im Stammhirn. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnsc

3 Ergebnisse 86 Abb. 3.8: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker NeuN im Kleinhirn. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnsch

3 Ergebnisse 87 Abb. 3.9: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker NeuN im Cortex. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnschni

3 Ergebnisse 88 Abb. 3.10: Alcianblaufärbung in Kombination mit dem neuronalen Marker NeuN im Stammhirn. Dargestellt sind 12-14 µm dicke Gehirnsc

3 Ergebnisse 893.1.3.2 Immunfluoreszenz Analyse der Sulfatid-Akkumulation in Neuronen im Cortex und im Stammhirn Mit der Immunfärbung sollte mit

3 Ergebnisse 90 Abb. 3.11: Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeschnitten des Cortex mit dem neuronalen Marker HRP-3. Co-Färbung von 12-14 µm dicke

3 Ergebnisse 91 Abb. 3.12: Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeschnitten des Cortex mit dem neuronalen Marker ß-III-Tubulin. Co-Färbung von 12-14 µ

3 Ergebnisse 92 Abb. 3.13: Immunfluoreszenz-Analyse von Gewebeschnitten des Cortex mit dem neuronalen Marker NSE. Co-Färbung von 12-14 µm dicken

3 Ergebnisse 93Besonders im Bereich der Mendulla oblangata waren viele mit Sulfatid angereicherte Neuronen zu finden. Diese Ergebnisse sind in den